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細胞克隆形成實驗，作為細胞生物學中的關鍵技術之一，不僅在學術研究中有著廣泛應用，更在藥物篩選、癌癥研究等領域發(fā)揮著重要作用。通過此實驗，我們能夠深入了解細胞的增殖能力、侵襲性，以及對不同治療因素的敏感性，為生物醫(yī)藥領域的創(chuàng)新提供堅實的基礎。
本期文章，我們將深度解析平板克隆和軟瓊脂克隆這兩種常用實驗方法，揭示它們的原理、實驗步驟以及注意事項！
實驗原理
細胞克隆實驗作為一項關鍵技術，被廣泛應用于生物學領域，以評估細胞的增殖、侵襲性和對殺傷因素的敏感性等生物特性。在實驗中，當單個細胞在離體條件下經過連續(xù)6代以上的增殖時，其后代將形成一個集體，通常被稱為細胞集落或克隆。細胞克隆形成率是一個衡量指標，表示細胞在接種后能夠存活并形成克隆的數量，即成功貼壁并展現增殖活力的細胞比例。
并非所有貼壁的細胞都能成功增殖和形成克隆，而只有那些成功貼壁并具備增殖活力的細胞才能成功形成克隆。因此，克隆形成率反映了細胞群體的依賴性和增殖能力這兩個重要特性，為生物學研究提供了有價值的數據。
克隆形成的目的
通過細胞克隆形成實驗，我們能夠評估細胞在處理后的增殖能力，具體表現為觀察處理后的細胞在培養(yǎng)板上形成克隆的能力。這一實驗不僅能夠提供對細胞增殖能力的直觀量化，還有助于評估不同殺傷因素（如藥物或基因）對腫瘤細胞增殖能力和群體依賴性的敏感性。
該實驗的另一個重要應用是評估細胞在體內形成腫瘤的潛力。并非所有癌細胞都具備在體內形成腫瘤的能力，但如果細胞在離體條件下表現出強大的克隆形成能力，這可能提示它們在體內形成腫瘤的潛力較大。因此，這種實驗可以被視為一種模擬體內腫瘤形成的離體實驗，為研究腫瘤生物學提供了有益的信息。
克隆形成的方法
細胞克隆形成實驗可根據所采用的培養(yǎng)介質的不同分為兩種主要類型：平板克隆和軟瓊脂克隆。
（1）平板克隆形成（Colony Formation on Solid Media）：
這一方法涉及將細胞培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上，通常適用于那些具有貼壁生長特性的細胞，使得細胞能夠附著在培養(yǎng)基表面。在平板克隆形成實驗中，細胞形成的克隆被定量測定，從而評估細胞的增殖能力。
（2）軟瓊脂克隆形成（Soft Agar Colony Formation）：
這一技術涉及將細胞混合到瓊脂糖中，使得細胞在瓊脂糖中懸浮，而不是附著在培養(yǎng)基表面。軟瓊脂克隆形成主要應用于研究懸浮生長的腫瘤細胞和轉化細胞系。通過這種方法，我們能夠評估細胞在三維環(huán)境中形成克隆的能力，從而更全面地了解其增殖和侵襲特性。
下文將詳細探討這兩種實驗技術的具體操作步驟，以便更深入地理解它們在生物學研究中的應用。
實驗過程
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平板克隆實驗過程
材料：基礎培養(yǎng)基(根據細胞選擇適用種類)、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-鏈霉素溶液(100X)、多聚甲醛固定、結晶紫染液、 Giemsa染液 。
實驗步驟：
（1）6孔板
1.將處于對數生長期的細胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基+10%胎牛血清)重懸成細胞懸液，并計數。
2.細胞接種：于6孔板培養(yǎng)板中各實驗組接種400-1,000個細胞/孔(根據細胞生長情況確定，一般為700個細胞/孔)。
3.繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數單個克隆中細胞數大于50為止，中途每隔3天進行換液并觀察細胞狀態(tài)。
4.克隆完成后，在顯微鏡下對細胞進行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次。
5.每孔加入結晶紫染液1ml，染細胞10-20 min。
6.PBS 洗滌細胞數次，晾干，數碼相機拍照(分別對整個六孔板及每個孔進行單獨拍照)。
克隆形成原始圖片（圖片來源于網絡）
注意事項：
1.每隔3天進行換液，在換液時，緩慢加入培養(yǎng)基，避免吹起細胞。
2.染色完成后，務必將染液清洗干凈，不要在孔中有殘留。
（2）平皿
1.取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在完全培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基+10%胎牛血清)中備用。
2.將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組5個平行樣。每組細胞每皿分別接種100個細胞于含10ml 37℃預溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。
3.置37℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。
4.當培養(yǎng)皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。
5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。
6.去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘。
7.用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。
8.將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(克隆數/接種細胞數)×100%。
DU145細胞克隆形成的圖片（相機左，顯微鏡右）
（圖片來源于網絡）
注意事項：
1.平板克隆形成實驗是一種容易操作的方法，特別適用于那些貼壁生長的細胞。這種實驗通常在玻璃底或塑料培養(yǎng)皿上進行。
2.實驗的關鍵成功因素在于細胞懸液的制備和接種密度。細胞懸液必須確保細胞均勻分散，不能有細胞團，而且接種密度不應過高。
數據分析：
使用顯微鏡觀察陽性克隆，即每個克隆包含超過50個細胞，然后使用相機拍照記錄。隨后，進行克隆數量的計算，這些克隆的大小通常在0.3到1.0毫米之間，并統(tǒng)計各個克隆的大小。
例如，在研究某個基因對細胞增殖的影響，如敲低前列腺癌細胞株PC3的TCTN1基因，可以使用顯微鏡拍攝圖像（比例尺為250微米），然后使用相機拍攝照片。結果顯示，TCTN1基因的敲低抑制了克隆的形成，減小了克隆的數量和大小。
（圖片來源于網絡）
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軟瓊脂克隆形成
軟瓊脂克隆形成實驗，又被稱為非錨定依賴性生長實驗（Anchorage-independent assay），利用軟瓊脂作為培養(yǎng)介質，推動細胞在懸浮狀態(tài)下進行生長。某些惡性腫瘤細胞不僅在貼壁狀態(tài)下能夠增殖，而且在懸浮狀態(tài)下同樣能夠展現增殖能力。這種通過在軟瓊脂中形成克隆的能力能夠有效反映細胞的惡性程度。
軟瓊脂克隆形成實驗不僅可用于深入研究細胞分化的基本原理，同時也為評估臨床腫瘤治療的療效提供了有力工具。在醫(yī)學和生物學領域，該實驗發(fā)揮著重要的作用，為我們更全面地理解細胞行為、腫瘤發(fā)展機制以及潛在治療策略的效果提供了關鍵信息。
具體過程如下圖所示：
（圖片來源于網絡）
1.配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后，維持在42℃中使其不會凝固。
2.將1.2% 瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固。
3.將制備好的單細胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培養(yǎng)基，每3天更換一次。
4.根據細胞的生長速度培養(yǎng)2~3周后顯微鏡下觀察克隆大小，與平板克隆一樣，每個克隆>50個細胞，顯微鏡拍照。若拍整個孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍(NBT)染色，37°C過夜，拍照。
5. 數據分析：顯微鏡或相機拍照，計算克隆形成率。
例：通過軟瓊脂克隆形成實驗檢測ME2蛋白對神經膠質瘤細胞生長的影響。在神經膠質瘤細胞GBM8401中將ME2蛋白敲低，形成的克隆數減少。
（圖片來源于網絡）
注意事項：
1.在培養(yǎng)皿中涂覆上層的軟瓊脂，以確保細胞分散成單個狀態(tài)；接下來，涂抹下層的軟瓊脂，起到支撐作用，以防止細胞附著并生長。最后，涂覆一層培養(yǎng)基，以防止瓊脂干燥，并為細胞提供所需的養(yǎng)分。如果需要對細胞進行藥物處理，藥物可以添加到培養(yǎng)基中。
2.上層軟瓊脂中的細胞數量會根據不同的細胞類型而有所不同。通常，使用5000個細胞/孔作為起始濃度，但可以根據需要進行調整。
3.瓊脂需要在水浴鍋中維持在約42℃左右的溫度。如果溫度太低，瓊脂會凝固，而如果在制備底層瓊脂時凝固過快，可能導致不均勻。另一方面，溫度過高可能會導致細胞受熱而死亡。此外，在實驗過程中需要操作迅速，以防止局部結塊的發(fā)生。
結論：
在選擇細胞克隆方法時，至關重要的是充分考慮實驗對象和研究目的。平板克隆適用于評估貼壁腫瘤細胞的增殖能力和致瘤性，而軟瓊脂克隆形成實驗不僅適用于貼壁細胞，還能有效檢測懸浮腫瘤細胞和轉化細胞系，因此在某些方面具有平板克隆無法替代的優(yōu)勢。
若只需簡單評估貼壁細胞的增殖能力和群體依賴性，選擇平板克隆方法已足夠。然而，若研究需要更全面地涵蓋懸浮細胞或轉化細胞系的特性，那么軟瓊脂克隆形成實驗可能更為適合。因此，在選擇克隆方法時，需綜合考慮研究深度和范圍，以確保選用的方法與研究目標相契合。
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