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科研技術(shù)服務(wù)
一、實驗原理
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。
目前使用的酶聯(lián)免疫檢測方法很多，其種類按檢測目的可分為：
間接法——用于測定抗體
雙抗體夾心法——主要用于測定大分子抗原
競爭抑制法——主要用于測定小分子抗原
雙抗體夾心法（測抗原)
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。
間接法測抗體
間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測抗體之標(biāo)本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標(biāo)記抗抗體，(對人的標(biāo)本來說即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM)，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色，底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結(jié)果可用目測或用分光光度計定量測定，本法用同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標(biāo)記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標(biāo)記抗人IgM，則可用于早期診斷。
競爭法測抗原
本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個過程，稱為包被（Coated），也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量。
這種方法所測定的抗原只要有一個結(jié)合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。該法的優(yōu)點是快，因為只有一個保溫洗滌過程。但需用較多量的酶標(biāo)記抗原為其缺點。
二、應(yīng)用簡介
酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各種細胞內(nèi)成份的定位。（2）研究抗酶抗體的合成。（3）顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。（4）定量檢測體液中抗原或抗體成份。
三、實驗方法
四、 樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見問題
1) 雙抗體夾心法（測抗原）
1.可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標(biāo)記測定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。
2.包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。
3.對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動物的臟器等，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。
4.用最適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟，而且可以克服前帶現(xiàn)象?？赏ㄟ^棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測定OD值，選擇OD值≥1.0的那個抗原稀釋度為最適包被濃度。一般總是要選擇那個OD值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清OD值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的OD值有明顯差別。
5.抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加完全且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如0.1 mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10 ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20 ug/ml較為合適，但均應(yīng)通過滴定。
2) 間接法（測抗體）
1.應(yīng)注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。
2.為了使特異性結(jié)合的抗體量盡可能多，包被微量反應(yīng)板凹孔的抗原應(yīng)該稍微過量。
3.在孵育或洗滌過程中，已吸附的抗原可能有部份會從固相載體上被洗滌下來。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會吸附到原來包被抗原凹孔的空白處，增加本底顏色，產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。
4.在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護性阻劑可用來抑制非特異性蛋白的競爭性吸附作用。
5.在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應(yīng)，而且還可增加陽性標(biāo)本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關(guān)。目前采用的洗滌劑為PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應(yīng)用。
3) 競爭法測抗原
1.試驗的重復(fù)性（精確度）
有二種方法來檢驗試驗的精確度：通常用變異系數(shù)來表示：1、幾個樣品用ELISA法同時進行多次測定求出CV%；2、不同時間對不同操作者對某幾個樣進行多次測定求出變異系數(shù)。CV是個體參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比率。
S / X＝CV，CV應(yīng)低10%，不應(yīng)大于10～15%。
不論目測或分光光度計測定，均可作一個稀釋度或一系列稀釋度測定，一般常規(guī)診斷只用一個稀釋度判斷陽性或陰性就可以了，這樣比較方便，現(xiàn)在推薦傳染病的血清診斷用1：200一個稀釋度。有些需要精確定量的，可作一系列稀釋度測定。
記錄結(jié)果有下列幾種方法：
1.“+”或“-”：所有超過規(guī)定的OD值（如OD，0.4）的標(biāo)本均屬陽性，此規(guī)定OD值是根據(jù)事先測定大量陰性標(biāo)本所取得的，此規(guī)定值是陰性標(biāo)本的上限。或者以一組陰性標(biāo)本OD平均值加2～3個標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性閾值。
2.直接以O(shè)D值來表示，如0.4、0.7、1.2，OD值越大，陽性反應(yīng)越強，但此數(shù)值是在固定實驗條件下得到的結(jié)果，而且每次實驗都要有參考標(biāo)本作對照。
3.以終點滴度表示：將標(biāo)本作連續(xù)稀釋，最高稀釋度能出現(xiàn)陽性反應(yīng)者（即OD值仍大于陽性閾值，即為該標(biāo)本的滴度。
4.以“比值表示：求出被檢標(biāo)本的OD值與一組陰性標(biāo)本OD值的比值，例如為陰性標(biāo)本的2倍或3倍，即為陽性，比值小于2.1而大于1.5為可疑，<1.5為陰性。
測定標(biāo)本OD值-空白OD值
陰性對照OD值-空白OD值
如在此測定時以空白校正“O”點。
5.以“單位”來表示：在測定被檢標(biāo)本的同時，再測定一個含已知單位數(shù)的陽性參考血清，用不同稀釋度作ELISA檢測后，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，單位數(shù)為橫坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后可根據(jù)被檢標(biāo)本的OD值，從曲線上找出相應(yīng)的單位數(shù)，再乘于血清的稀釋倍數(shù)，即可得出被檢標(biāo)本的單位數(shù)。
作試驗時的陰性參考血清最好不要顯色，否則會對結(jié)果判斷帶來困難，特別在目測時，當(dāng)陽性標(biāo)本OD值>2.0時，應(yīng)作適當(dāng)稀釋后再作測定。
6.對使用儀器要求
所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔，用于酶結(jié)合和底物的吸管和容器一定要分開。試劑要求標(biāo)準(zhǔn)化。
七、服務(wù)流程
