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科研技術(shù)服務(wù)
一、 實(shí)驗(yàn)原理
慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄、包裝、重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝。包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。離心收集上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。
二、應(yīng)用簡(jiǎn)介
慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因研究載體，區(qū)別于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)于分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。
實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的慢病毒系統(tǒng)屬于第三代慢病毒系統(tǒng)，生物安全性高，采用VSVG包膜，宿主范圍廣泛，慢病毒滴度高，其病毒滴度可以達(dá)到10^9TU/mL。
目前的慢病毒載體有CMV、mCMV、CAG、PGK、UbC、EF1a、GFAP、NSE等多種啟動(dòng)子可供選擇；而且還有EGFP、ZsGreen、tdTomato、mCherry、EYFP等多種熒光標(biāo)記蛋白可供選擇；抗生素篩選基因有Puromycin、Neomycin、Hygromycin等可供選擇。
在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過使用病毒介導(dǎo)的方式能夠大大提高基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，達(dá)到目的基因高效表達(dá)的目的。
具體來說，慢病毒包裝主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：
1、對(duì)于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，極大地方便了RNAi，cDNA克隆以及報(bào)告基因的研究；
2、進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選；
3、為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液。
三、 實(shí)驗(yàn)方法
四、樣本送檢要求
交付標(biāo)準(zhǔn)：
滴度:>108TU/ml
規(guī)格:1ml
贈(zèng)送陰性對(duì)照病毒規(guī)格:0.2ml（>108TU/ml）
五、案例展示
六、常見問題
1．慢病毒理論上可以包裝5～7Kbp的片段，但過大的片段包裝會(huì)影響病毒的出毒效率，導(dǎo)致獲得的病毒滴度較低，影響病毒感染效果。因此一般建議最好將包裝的片段控制在1.5Kbp以內(nèi)。
2．病毒載體易突變和丟失，克隆過程中可能出現(xiàn)質(zhì)粒的包裝信號(hào)突變或大小不等的片段丟失，導(dǎo)致無法成功包裝出病毒。因此建議構(gòu)建好含有目的基因的克隆載體(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先進(jìn)行測(cè)序，以確保關(guān)鍵序列都正確無誤。
3．包裝細(xì)胞多選擇為293T或293FT。要求細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、狀態(tài)良好，避免過密生長(zhǎng)和體外傳代次數(shù)過多。
4．轉(zhuǎn)染時(shí)對(duì)質(zhì)粒純度要求較高，最好為去掉內(nèi)毒素的超螺旋質(zhì)粒，以提高轉(zhuǎn)染效率。多采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法，既節(jié)約成本又可獲得高的轉(zhuǎn)染效率(一般可達(dá)到80％～95％)。
5．無論是三質(zhì)粒或四質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染的各質(zhì)粒之間的比例非常重要，直接影響出毒效率。不同公司提供的質(zhì)粒有所差別，因此無法一概而論，需要根據(jù)給出的比例進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化。
6．轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞密度控制在50％～60％為佳。轉(zhuǎn)染前4～8h換液，轉(zhuǎn)染后不換液。轉(zhuǎn)染第2天添加丁酸鈉(TPA)可明顯提高出毒率，之后8h再換液。每次換液前應(yīng)將培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃，換液時(shí)動(dòng)作輕柔以防細(xì)胞漂起。
7.一般情況下，轉(zhuǎn)染48h后收獲得到的病毒顆粒最多，但也與當(dāng)時(shí)細(xì)胞狀態(tài)、生長(zhǎng)速度和培養(yǎng)基pH值有關(guān)。收獲病毒時(shí)培養(yǎng)基應(yīng)呈紅色，若過酸呈現(xiàn)黃色則會(huì)降低病毒收獲率。
8.不同廠家和批次的血清對(duì)病毒的產(chǎn)量影響很大，需要篩選。
9．病毒液避免反復(fù)凍融，否則明顯降低效率。
10．一般情況下，病毒液于-80℃中可保存1年，但建議半年之后重新檢測(cè)病毒滴度。
七、服務(wù)流程
