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2022-06-08 17:50:44
Transwell遷移/侵襲實驗

【實驗原理】

Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分,含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖,鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上,能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結構,這種膜結構與天然基質膜結構極為相似。

濾膜孔徑一般為8um,而且膜孔都被Matrigel覆蓋,細胞不能自由穿過,必須分泌水解酶,并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜,這與體內情況較為相似。

鋪有Martrigel的濾膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之間,鋪有Martrigel面朝向上室,在下室中加有趨化劑,如一定濃度的LN、FN或小鼠3T3條件培養(yǎng)液或人睪丸上皮成纖維細胞培養(yǎng)液,上室加入重懸的瘤細胞,具有侵襲能力的細胞在趨化劑誘導下開始穿膜運動。細胞穿膜所用的時間與Martrigel的用量有關,選擇25ugMartrigell鋪膜,16小時后觀察結果較為合適。穿過濾膜的細胞多數(shù)粘附在濾膜下表面,可用棉簽將上表面的細胞拭去,然后用乙醇固定濾膜,PE染色,在光鏡下觀察統(tǒng)計穿過Martrigel的細胞數(shù)。另外用Transwell小室也可進行重建基質膜侵襲分析,這一方法是在Transwell小室吊籃式上腔的濾膜上鋪上30ugMartrigel,加入細胞72h后觀察結果。值得注意的是,細胞在TransWll腔中培養(yǎng)72小時后,有相當數(shù)量穿過濾膜的細胞不再粘附在濾膜下表面,而是脫落進人下腔溶液中.因此統(tǒng)計穿過基質膜的細胞數(shù)目時應把這部分細胞考慮在內。腫瘤細胞穿過重建基質膜的能力與它的體內侵襲轉移能力表現(xiàn)出較好的相關性,可以用重建基質膜模型初篩抗侵襲藥物。 

在上述分析中,如果不在膜上鋪Martrigel而直接將8um孔徑濾膜安放在侵襲腔室上下腔室之間,細胞通過變形運動穿過濾膜,用這種模型對分析細胞運動能力和藥物對細胞運動能力的影響。另外,在下室中加有LN或FN或在濾膜下表面鋪上LN或FN,可分析藥物對腫瘤細胞的趨化性或趨固性的影響。

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【應用簡介】

腫瘤細胞侵襲實驗(TumourInvasionAssay)可應用于:

1)研究各種細胞因子對惡性腫瘤細胞侵襲和轉移的影響;

2)一些抑制血管生成的新藥研究;

3)研究腫瘤細胞侵襲和轉移機制。

 

【實驗方法】

Step1:制備條件培養(yǎng)基

Step2:包被基底膜

Step3:水化基底膜

Step4:接種細胞

Step5:培養(yǎng)細胞

Step6:固定及染色

Step7:鏡檢

 

【樣本送檢要求】

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【案例展示】

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【常見問題】

1、24孔板下室一般加入600ul的培養(yǎng)基,特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產生,一旦產生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時候要特別留心,一旦出現(xiàn)氣泡, 要將小空提起,去除氣泡,再將小室放進培養(yǎng)板;

2、接種的細胞應選擇處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好,細胞計數(shù)需準確;

3、待細胞遷出,且形態(tài)展開后即可固定染色;

4、染色后,可用棉簽輕輕擦掉上層未遷出細胞;

5、拍照時,同一視野不可重復拍照,膜上小孔清晰,細胞形態(tài)明顯,所有照片的背景需統(tǒng)一。

 

【服務流程】

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