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科研技術(shù)服務(wù)
一、實(shí)驗(yàn)原理
Southern blot又稱凝膠電泳壓印雜交技術(shù),該方法利用硝酸纖維膜或?yàn)V紙或尼龍膜等具有吸附DNA的功能,先將DNA片段作凝膠電泳,并將電泳后的DNA區(qū)帶吸附到膜上,然后直接在膜上進(jìn)行同位素標(biāo)記探針與被測(cè)DNA之間的雜交,最后通過(guò)放射自顯影對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè),以此探測(cè)一個(gè)DNA樣品中含有的特定DNA序列。
二、應(yīng)用簡(jiǎn)介
技術(shù)應(yīng)用
1、定性及定量分析基因組中特定基因；
2、基因突變分析及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。
應(yīng)用范圍
1.遺傳病診斷：傳統(tǒng)的基因診斷技術(shù)主要是以基因探針技術(shù)為基礎(chǔ)而建立的一些檢測(cè)方法-Southern blot。
2.DNA圖譜分析：a.高度的特異性；b.穩(wěn)定的遺傳性；c.體細(xì)胞穩(wěn)定性
3.檢測(cè)樣品中的DNA及其含量
4.PCR產(chǎn)物分析
三、 實(shí)驗(yàn)方法
四、樣本送檢要求
五、案例展示
六、常見(jiàn)問(wèn)題
1、核酸質(zhì)量對(duì)southern雜交實(shí)驗(yàn)的影響
答：核酸質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響是直接的，既要求客戶提供的總量足夠——實(shí)驗(yàn)消耗（上樣量），又要求保證質(zhì)量——按要求準(zhǔn)備材料。
DNA樣品一般對(duì)OD值和濃度有如下要求：OD260/280=1.8～2.0，OD260/230＞2.0，濃度≥100 ng/ul。同時(shí)，需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示該DNA樣品無(wú)蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)污染，無(wú)降解彌散，條帶清晰。
2、探針設(shè)計(jì)是怎么回事，有哪些原則？
答：探針就是與待測(cè)目的基因序列同源的一段地高辛標(biāo)記的DNA序列，可以和酶切后的基因組片段特異性的結(jié)合。 探針設(shè)計(jì)有如下幾個(gè)原則:
(1)、長(zhǎng)度適中。探針的片段長(zhǎng)度一般控制在300-1000bp，探針太長(zhǎng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合的概率增加，探針太短時(shí)，探針結(jié)合的地高辛標(biāo)記物太少，會(huì)導(dǎo)致發(fā)光信號(hào)減弱。
(2)、特異性強(qiáng)。最佳的探針序列是僅與目的基因同源，與整個(gè)基因組序列的同源片段低于30%。
(3)、ATGC含量均勻，無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)和高度重復(fù)序列。
3、基因組片段化時(shí)使用限制性內(nèi)切酶是怎么選擇的？
答：(1)、目的基因序列中不能含有該位點(diǎn)
(2)、常用的內(nèi)切酶，價(jià)格優(yōu)惠、酶切效率高
(3)、預(yù)實(shí)驗(yàn)可以把基因組片段化，電泳檢測(cè)彌散狀態(tài)看不到明顯的主帶。
(4)、根據(jù)轉(zhuǎn)化載體上的酶切位點(diǎn)選擇
4、如何減少非特異的曝光條帶？
我們采用PCR法合成雙鏈的地高辛標(biāo)記的探針，電泳檢測(cè)探針是否標(biāo)記成功，若條帶單一，且略大于對(duì)照組，則認(rèn)為探針合成成功（如圖3所示）。
此外，和合成探針前，需要在NCBI上比對(duì)探針序列，若沒(méi)有在待測(cè)物種中Blast到高同源性的序列，則認(rèn)為該探針是特異的。6、檢測(cè)結(jié)果陰性有哪些因素造成的？
答：在southern雜交服務(wù)中，大概總結(jié)為一下幾類原因：
(1)、基因組中目的基因豐度很低，低于southern blot雜交實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)下限（目的基因的量低于0.1pg）
(2)、在該物種基因組信息不全的狀態(tài)下，探針序列特異性很難保證，結(jié)果出現(xiàn)大量的非特異性條帶。
(3)、基因組質(zhì)量達(dá)不到要求
(4)、待測(cè)樣品的確為陰性
(5)、酶切方案的影響
七、服務(wù)流程
