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科研技術(shù)服務(wù)
一、 實(shí)驗(yàn)原理
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
二、應(yīng)用簡(jiǎn)介
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最終通過(guò)相對(duì)定量或絕對(duì)定量的方法確定各個(gè)樣本的本底表達(dá)量。
相關(guān)應(yīng)用
1.臨床疾病診斷
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。
2.動(dòng)物疾病檢測(cè)
禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門(mén)菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲(chóng)病等、炭疽芽孢桿菌。
3.食品安全
食源微生物、食品過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測(cè)。
4.科學(xué)研究
醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。
5.應(yīng)用行業(yè)
各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。
由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。
三、實(shí)驗(yàn)方法
四、 樣本送檢要求
五、案例展示
六、 常見(jiàn)問(wèn)題
1) 引物設(shè)計(jì)
1、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；
2、Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp-150bp；
3、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)；
4、典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；
5、引物之間的Tm值相差避免超過(guò)2°C；
6、引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基；
7、為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子；
8、探針位置盡可能地靠近上游引物；
9、探針的5'端應(yīng)避免使用堿基G，引物的3’端避免使用堿基A。探針長(zhǎng)度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C ,通常比引物Tm高5 ~10°C，GC含量在40%~ 70%；
10、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量；
11、為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計(jì)好的序列在Blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。
2) 熱啟動(dòng)
熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。
3) 鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個(gè)方面，如：對(duì)DNA聚合酶的活性的影響進(jìn)而影響產(chǎn)量;對(duì)引物退火的影響，進(jìn)而影響特異性。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量。
4) 模板質(zhì)量
模板的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會(huì)抑制PCR。
5) 防止殘余污染
1、PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來(lái)進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來(lái)源的污染。這稱之為殘余污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會(huì)是污染源(非殘余污染)。
2、可以在PCR過(guò)程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫?duì)照檢測(cè)污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成份，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試劑單獨(dú)加入。
七、服務(wù)流程
