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隨著當代醫(yī)學的進展，除了傳統(tǒng)的傳統(tǒng)病理學技術外，分子病理學在疾病的診斷、靶向位點篩查和預后分層等診療全過程中正扮演著日益關鍵的角色。在眾多分子病理學技術中，熒光原位雜交技術（FISH）作為其中最基礎且至關重要的一項，正在發(fā)揮著無法替代的價值。那么，FISH技術究竟是什么？其主要用途和實驗流程又是怎樣的？

1.指導靶向藥物的應用，例如乳腺癌中的赫賽?。℉ER2）以及肺癌中的克唑替尼（ALK/ROS1/CMET）等，旨在通過對分子病理信息的準確分析，實現個體化治療方案的制定。

2.用于指導腫瘤的預后評估，例如對于腦膠質瘤，通過檢測1p和19q的缺失情況，以及神經母細胞瘤和分化型神經母細胞瘤中的NMYC表達等，從而提供對腫瘤發(fā)展和患者預后的精準信息。

1.通過分子病理學技術明確各種血液腫瘤的診斷，如急性早幼粒白血病中的t(15;17)、慢性粒細胞白血病中的t(9;22)、套細胞淋巴瘤中的t(11;14)、Buikitt淋巴瘤中的c-MYC基因重排，以及雙打擊及三打擊淋巴瘤中的MYC、BCL2、BCL6等基因變異。這些特異性分子標志物的檢測為準確診斷不同血液腫瘤提供了重要依據。

2.在血液腫瘤領域，對于急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤等疾病，通過危險分層的手段，實現對患者的風險評估，為制定個性化的治療方案提供有力支持。

3.進行染色體隱蔽易位或無法通過常規(guī)細胞遺傳學檢測的異常的檢測。

4.對微小殘留病變進行定量分析，同時評估大量分裂和非分裂細胞，以判定細胞遺傳學緩解和復發(fā)情況（其靈敏度相較于實時定量PCR較低）。

基因定位是熒光原位雜交的最基礎最成功的應用。利用熒光原位雜交靈敏、準確，并且可以一次檢測多段基因等特點，可以確定目標基因的準確位置，確定幾個基因之間的位置關系，以及基因與染色體端粒之間的關系，基因與著絲點的關系，是構建基因圖譜的基本要素。目前熒光原位雜交技術被廣泛地應用于基因的物理定位及基因圖譜的繪制

FISH DNA探針可劃分為位點特異性探針和著絲粒探針，其中位點特異性探針又可細分為計數探針和融合/分離探針。在臨床應用中，位點特異性探針目前更為廣泛使用。

計數探針采用標記特異性DNA片段的方式，通過計算信號數量來判斷染色體或基因狀態(tài)的一種標記探針。由于正常人的染色體/基因是二倍體，因此正常檢測信號數為兩個。當信號數多于兩個或少于兩個（排除切片影響）時，可推斷染色體或基因發(fā)生了異常（擴增或缺失）。

融合/分離探針在基因發(fā)生重排時，會在相對穩(wěn)定的位置發(fā)生斷裂。該探針利用不同顏色的熒光素標記斷裂點兩端的特異性DNA片段，通過觀察信號點顏色的變化來判斷是否發(fā)生了融合或分離事件。在基因未發(fā)生重排時，探針標記的紅綠信號由于相隔距離太近，會在肉眼觀察下呈現混色（黃色）。當發(fā)生斷裂時，形成獨立的顏色信號（單獨的紅色或綠色）。當然，結構探針同樣能夠指示數目異常，如多倍體情況。

1.人的 MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色體細胞標本；
2.指甲油、甲酰胺、NaCl、檸檬  酸  鈉、氫氧  化鈉、吐溫 20 等；
3.恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、Nikon E-400 熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等。

（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g 檸檬酸鈉，加水至 1 000 mL（用 10 mol/L NaOH調 pH 至 7.0）。
（2）去離子甲酰胺（DF）：將 10 g 混合床離子交換樹脂加入 100 mL 甲酰胺中。電磁攪拌 30 min，用 Whatman l 號濾紙濾。
（3）體積分數 70%甲酰胺/2×SSC：35 mL 甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL 水。
（4）體積分數 50%甲酰胺/2×SSC：100 mL 甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL 水。
（5）體積分數 50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
（6）雜交液：8 μL 體積分數 25%DS，20 μL 20×SSC 混合。（或 40 μL 體積分數 50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O 混合）取上述混合液 50 μL，與 5 μL DF 混合即成。其終濃度為體積分數 10% DS，2×SSC，體積分數 50% DF。
（7）PI/antifade 溶液
PI 原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為 100 μg/mL，取出 1 mL，加 39 mL 雙蒸水，使終濃度為 2.5 μg/mL。Antifade 原液：以 PBS 緩沖液配制該溶液，使其濃度為 10 mg/mL，用 0.5 mmol/L 的 NaHCO3 調 pH 值為 8.0。取上述溶液 1 mL，加 9 mL 甘油，混勻。PI/antifade 溶液：PI 與 antifade 原液按體積比 1:9 比例充分混勻，－20℃保存?zhèn)溆谩?br/>（8）DAPI/antifade 溶液：用去離子水配制 1mL/mg DAPI 儲存液，按體積比 1:300，以antifade 溶液稀釋成工作液。
（9）封閉液 I：體積分數 5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
（10）封閉液 II：體積分數 5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL 混合。
（11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分數 5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL 混合。
（12）洗脫液：100 mL 20×SSC，加水至 500 mL，加 Tween20 500 μL。

在75℃的恒溫水浴中，對探針進行溫育5分鐘，然后迅速將其置于0℃，持續(xù)5至10分鐘，以完成雙鏈DNA探針的變性過程。

（1）將準備好的染色體玻片標本放置于50℃的培養(yǎng)箱中烤片2至3小時。（對經Giemsa染色的標本，在烤片前需先在固定液中進行褪色處理）。
（2）將玻片標本取出，浸泡在70～75℃的70%甲酰胺/2×SSC變性液中，進行2～3分鐘的變性處理。
（3）立即按照順序將標本在70%、90%和100%體積分數的冰乙醇中進行脫水處理，每個濃度持續(xù)5分鐘，然后進行空氣干燥。

取已變性或預退火的DNA探針10μL滴在已變性且脫水的玻片標本上，覆蓋18×18蓋玻片，用Parafilm密封，放置于37℃的濕暗盒中進行雜交，持續(xù)過夜（大約15～17小時）。由于雜交液較少，溫度相對較高，而且持續(xù)時間較長，為了保持標本的濕潤狀態(tài)，該過程在濕盒中進行。

執(zhí)行此步驟有助于去除非特異性結合的探針，有效降低背景信號。
（1） 在雜交的第二天，從37℃溫箱中取出標本，輕輕使用刀片揭開蓋玻片。
（2） 將已完成雜交的玻片標本放入預熱至42～50℃的50%甲酰胺/2×SSC溶液中，進行3次洗滌，每次5分鐘。
（3） 在已升溫至42～50℃的1×SSC中進行3次洗滌，每次5分鐘。
（4） 在室溫下，輕輕將玻片標本在2×SSC中漂洗一次。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200μL的復染溶液（可以是PI/antifade或DAPI/antifade染液），滴在玻片標本上，然后蓋上蓋玻片。

（1） 在玻片的雜交部位加 150 μL 封閉液 I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育 20min。
（2） 去掉保鮮膜，再加 150 μL avidin-FITC 于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育 40 min。
（3） 取出標本，將其放入已預熱 42～50℃的洗脫液中洗滌 3 次，每次 5 min。
（4） 在玻片標本的雜交部位加 150 μL 封閉液 II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育 20 min。
（5） 去掉保鮮膜，加 150 μL antiavidin 于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育 40 min。
（6） 取出標本，將其放入已預熱 42～50℃的新洗脫液中，洗滌 3 次，每次 5 min。
（7） 重復步驟（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室溫清洗一下。
（8） 取出玻片，自然干燥。（9） 取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

可以選擇采用不同類型的封片液。如果封片液中未包含Mowiol（這有助于產生自封閉效應），為了防止蓋片與載玻片之間的溶液揮發(fā)，可以在蓋玻片周圍使用指甲油進行封閉。經過封閉處理的玻片標本可在-20℃至-70℃的冰箱內的暗盒中保存數月。

首先，在可見光源下定位顯示細胞分裂相的視野，然后啟動熒光激發(fā)光源，FITC的激發(fā)波長為490 nm。通過PI染色，細胞呈現紅色，而由FITC標記的探針位置則發(fā)出綠色熒光。