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新聞資訊
01
簡介
經(jīng)過包埋的組織在普通玻片上進(jìn)行切片后，可以使用HE染色，這種方法通過區(qū)分細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的酸堿性特性，將它們?nèi)境商焖{(lán)和玫紅兩種鮮艷的顏色，以滿足形態(tài)學(xué)觀察的需求。如果需要進(jìn)行免疫組化或熒光分析，那么在切片時需要在玻片上使用粘片劑，以防止在多個操作步驟中出現(xiàn)掉片的情況。
02
基本原理
HE染色方法之所以廣泛應(yīng)用于細(xì)胞染色領(lǐng)域，是因為它在化學(xué)反應(yīng)之外還涉及物理吸附和吸收效應(yīng)，這些效應(yīng)共同促成了HE染色的出色核漿對比效果。這個方法利用了蘇木素染色液的堿性屬性，將細(xì)胞染成藍(lán)色，以及伊紅的酸性屬性，將細(xì)胞染成紅色。結(jié)果是，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。這兩種不同的染色液通過改變細(xì)胞的折射率，使細(xì)胞在光鏡下呈現(xiàn)出不同的顏色，從而呈現(xiàn)出細(xì)胞圖像。
圖片來源于網(wǎng)絡(luò)
03
HE染色實驗材料與儀器
器材：染缸、蓋玻片、組織切片
試劑：① C8H10、② 乙醇、③ 蘇木素染液、④ 蒸餾水、⑤ 中性樹膠
04
HE染色操作步驟
將已烘干的切片在C8H10中脫蠟 5～10 分鐘，兩次。
移入C8H10和純乙醇（1：1）混合液中 5 分鐘左右（如經(jīng)二次C8H10脫蠟，此步可省略）。
移入 100％、95％、85％、70％ 乙醇中，各級為 2～5 分鐘。最后經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入染色液。
自己配制或商業(yè)化購買的蘇木素染液染色 5～15 分鐘。
流水沖洗 15～30 分鐘，或者在 0.75％ 氯化銨溶液中短時間堿化或藍(lán)化，使細(xì)胞核呈藍(lán)色。
蒸餾水短洗。
依次經(jīng) 70％、85％、95％ 乙醇脫水，各級為 2～3 分鐘。
0.1％～0.5％ 伊紅染液染色 1～5 分鐘，若著色困難，可在每 100 ml 染液中加入 1～2 滴無水乙酸，使易著色且不易脫色。
依次快速通過 95％ 和 100％ 乙醇洗去多余的伊紅染液，在濃度 95％ 以下的乙醇中伊紅易脫色，應(yīng)適當(dāng)縮短時間。
C8H10透明（二次），共約 10 分鐘。
封片擦去切片周圍多余C8H10，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固，避免產(chǎn)生氣泡。在通風(fēng)櫥中吹干C8H10，封片穩(wěn)定后轉(zhuǎn)移到片盒中保存。
05
案例展示
圖片來源于網(wǎng)絡(luò)
06
注意事項
當(dāng)進(jìn)行免疫組化或熒光分析時，在切片過程中需要應(yīng)用粘片劑于玻片，以確保切片在多個處理步驟中不會脫落或掉落。
07
常見問題
1.切片染色不勻
1.1組織取材固定不當(dāng)。
如組織取材過大或過厚，不能將組織完全固定，組織切片染色后出現(xiàn)外周固定好的部分易著色，而中間未固定好的組織，細(xì)胞著色模糊，使染色不均。在送檢的標(biāo)本中，及時用4%中性甲醛對標(biāo)本固定，固定液應(yīng)是標(biāo)本的4倍。大標(biāo)本應(yīng)切開固定。
1.2切片薄厚不均或有橫紋。
切片刀有缺口時，易造成斷裂，破碎和不完整；切片刀傾角過大上卷，不能連在一起，過小則切片皺起。
或因螺絲松動產(chǎn)生振動切片易造成厚薄不均或技術(shù)人員手臂搖動切片機(jī)頭力量不均易造成橫紋。
切片時檢查切片機(jī)螺母是否擰緊，切片刀角度是否過大或過小即可。
1.3組織脫水，透明和浸臘處理不當(dāng)
（1）組織脫水用的各級乙醇未能保證相應(yīng)濃度使組織脫水不徹底。
（2）二甲苯內(nèi)的時間過長組織易碎也無法切出好片子。
（3）浸臘溫度過高，組織變脆也不利切片染色。
1.4染色過程處理不當(dāng)
（1）組織切片脫臘不徹底，如二甲苯時間過久 ，無水乙醇不純或時間過久，室溫低，組織切片上的石蠟沒有全部除掉時，含臘部分不著色或著色過淺染色液試劑量少，組織切片沒有全部浸到 。
（2）組織切片上在撈片時有氣泡，則氣泡內(nèi)組織可能染色不均。
2.切片染色模糊不清
2.1取材：
組織標(biāo)本已發(fā)生自溶或取材后沒及時固定或固定液濃度不夠；另固定前干枯標(biāo)本，染色后易出現(xiàn)灰染現(xiàn)象，很難補(bǔ)救。
2.2固定
（1）固定劑對組織有一定媒染作用，它既可與蛋白結(jié)合又能與染料結(jié)合，可增強(qiáng)著色能力，同時能沉淀和凝固細(xì)胞內(nèi)成分，使細(xì)胞內(nèi)成分產(chǎn)生不同折光率造成光學(xué)差異，故固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因。
（2）在日常病理制片中淋巴結(jié)處理不當(dāng)造成切片染色后組織見發(fā)灰現(xiàn)象，其主要原因由于細(xì)胞密集，結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致固定液難以滲透到組織深部，從而造成組織中央固定不佳，而出現(xiàn)徹底發(fā)灰現(xiàn)象。可用等量無水乙醇乙醚混合液處理切片5-10分鐘，乙醇洗，水洗，3%硫酸鐵銨溶液補(bǔ)充媒染5分鐘既可。
（3）送檢標(biāo)本部分用乙醇固定組織，常溫下乙醇的白蛋白，球蛋白不再溶于水，而核蛋白則可溶于水。故乙醇固定標(biāo)本切片，切片染色不良，細(xì)胞質(zhì)染色較差。切片出現(xiàn)模糊不清現(xiàn)象，其補(bǔ)救辦法用4%中性甲醛對標(biāo)本再固定。
3.其他原因
3.1溫度：
包埋/切片后烤片溫度過高，均會使蛋白發(fā)生質(zhì)變可能發(fā)生拒染，造成切片染色模糊不清。
3.2染料：
質(zhì)量差或溶液配制不當(dāng)，如配制蘇木精時加熱使氧化過度，不能生成三氧化蘇木紅生成四氧化蘇木紅使染液沒有染色能力或蘇木精使用時間過久，導(dǎo)致切片著色能力或蘇木精使用時間過久，導(dǎo)致切片著色不良，切片模糊不清。
3.3分化過度，細(xì)胞核著色淡
3.4脫水
透明不徹底：切片如在二甲苯中有白霧現(xiàn)象發(fā)生即表示乙醇脫水未盡，應(yīng)立即返回重新脫水。否則，鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊不清。
3.5封固
（1）注意避免封片者口鼻呼出氣接觸組織上封劑，因呼出氣體中會含水分。
（2）在潮濕環(huán)境中動作要快，以免空氣水進(jìn)入封固內(nèi)響質(zhì)量。