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新聞資訊
01 簡介
逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）的基本原理是從組織或細胞中提取總RNA，將其中的mRNA作為模板，并利用逆轉錄酶將其反轉錄成相應的cDNA。隨后，以這些合成的cDNA為模板進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，從而得到所需的基因或用于檢測基因表達的產物。
RT-PCR通過提升RNA檢測的敏感性，實現(xiàn)了對微量RNA樣品的高效分析。該技術的主要應用包括：分析基因的轉錄產物、獲取目標基因、合成cDNA探針，以及構建具有高效轉錄能力的RNA系統(tǒng)。
兩步法：先RT，再PCR（圖片來源于網(wǎng)絡）
一步法：在一個反應管內，RT和PCR同時進行 （圖片來源于網(wǎng)絡）
02 反轉錄酶的選擇: 1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶表現(xiàn)出強大的聚合酶活性，而其RNA酶H活性相對較為有限。其最適操作溫度為37℃。
2、禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶展現(xiàn)出卓越的聚合酶活性和RNA酶H活性，其最適操作溫度為42℃。
3、嗜熱微生物，如Thermus thermophilus和Thermus flavus，產生的熱穩(wěn)定性反轉錄酶在Mn2+存在下表現(xiàn)出高溫下反轉錄RNA的能力，有助于消除RNA模板的二級結構。
4、MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體，以Superscript和SuperScriptⅡ為商品名。這種酶相較于其他同類酶更能有效地將更大部分的RNA轉換為cDNA。這一特性使得在含有二級結構、難以進行低溫反轉錄的mRNA模板中，能夠合成更長的cDNA。
03 合成cDNA引物的選擇
1、隨機六聚體引物具有不特異性，用于在特定mRNA因含有使反轉錄酶終止的序列而難以復制其全長序列的情況下進行反轉錄。采用這種引物的方法中，體系中的所有RNA分子都作為cDNA的第一鏈模板，而PCR引物在擴增過程中賦予所需的特異性。通常，通過這種引物合成的cDNA中，有96%來自rRNA。
2、Oligo(dT)是一種特異于mRNA的策略。由于大多數(shù)真核細胞mRNA的3'端具有Poly(A+)尾，Oligo(dT)與之配對，只有mRNA才能被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，因此使用這種引物合成的cDNA相比使用隨機六聚體引物，得到的cDNA在數(shù)量和復雜性方面都較小。
3、特異性引物采用含有目標RNA互補序列的寡核苷酸作為引物，這是引發(fā)最為特異反應的一種方法。在PCR反應中，如果使用兩個特異性引物，第一條鏈的合成可以由與mRNA 3'端最靠近的引物起始。通過這種引物，只產生所需的cDNA，從而導致更為特異的PCR擴增。
04 實驗操作
一、實驗材料、試劑、儀器：
組織 細胞。
RNA提取試劑、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一鏈cDNA合成試劑盒。
離心管、離心機、水浴鍋、PCR管、電泳儀、凝膠圖像分析系統(tǒng)、移液管、移液槍、離心管盒。
二、實驗步驟：
（1）、總RNA的提取：見 總RNA的提取 相關內容。
（2）、cDNA第一鏈的合成
目前市面上有多家生物試劑公司提供各種cDNA第一鏈試劑盒，它們的基本原理相似，但具體的操作步驟可能有所不同。以下以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis試劑盒為例說明。
1、在0.5 ml微量離心管中，加入總RNA 1-5 ug，補充適量的DEPC H2O使總體積達11 ul。在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，輕輕混勻、離心；
2、70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min；
3、取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 ul；上游引物（10 pM） 2 ul；下游引物（10 pM） 2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul） 1 ul。輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5 min；
4、加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；
5、于70℃加熱15 min以終止反應；
6、將管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>
（3）、PCR
1、取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；
2、加入適量的ddH2O，使總體積達50 ul。輕輕混勻，離心；
3、設定PCR程序。在適當?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán)。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照；
4、電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果；
5、密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進行密度掃描。
05 注意事項
1、在實驗過程中，需采取措施防止RNA的降解，以保持RNA的完整性。在進行總RNA提取時，特別需注意避免mRNA的斷裂； 2、為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；
3、內參的設定主要用于靶RNA的定量。常用的內參包括G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免由于RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一和不同孔間溫度差異等引起的誤差；
4、PCR反應出現(xiàn)平臺效應與擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA的起始數(shù)量有關，因此不能確定PCR反應何時進入平臺期。為了確定每個目標序列的平臺效應循環(huán)數(shù)，需要進行單獨的實驗；
5、為了防止DNA的污染，可以采用DNA酶處理RNA的方法。在可能的情況下，建議將PCR引物放置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。