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石蠟切片免疫組化實(shí)驗(yàn)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究不可或缺的工具，融合了組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)，為深入了解疾病機(jī)制和提供精準(zhǔn)診斷提供了強(qiáng)大支持。本文將探討該實(shí)驗(yàn)的原理、關(guān)鍵步驟、和廣泛應(yīng)用。
簡(jiǎn)介
免疫組化（IHC）是一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)，通過應(yīng)用具有高度特異性結(jié)合能力的抗原抗體及顯色反應(yīng)，以對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行精準(zhǔn)定位、定性和相對(duì)定量的深入研究。該技術(shù)基于抗體與抗原的高度特異性結(jié)合機(jī)制，首先使得抗體與組織或細(xì)胞中的目標(biāo)蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，隨后通過化學(xué)手段將抗體結(jié)合的位置可視化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織或細(xì)胞中未知抗原的定性、定位和定量研究。免疫組化在解剖學(xué)、病理學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用，為深入理解細(xì)胞和組織中分子水平的變化提供了強(qiáng)有力的工具。
應(yīng)用范圍
免疫組化在疾病診斷、生物學(xué)研究和藥物開發(fā)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在臨床應(yīng)用方面，通過利用特定的腫瘤標(biāo)志物，醫(yī)生可以運(yùn)用免疫組化技術(shù)來確診腫瘤的良惡性，明確其分期和分級(jí)，并確定細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)移的源頭，以便精準(zhǔn)定位原發(fā)腫瘤。免疫組化在多種非腫瘤性疾病和病癥的診斷中充當(dāng)主要工具或確認(rèn)程序的重要角色。
在科研領(lǐng)域中，免疫組化可獨(dú)立應(yīng)用，也可與其他分析技術(shù)結(jié)合，用于深入研究正常組織和器官的發(fā)育、病理過程、傷口愈合、細(xì)胞死亡和修復(fù)等多個(gè)領(lǐng)域。此外，免疫組化還在藥物開發(fā)中扮演重要角色，通過檢測(cè)靶組織和其他部位疾病標(biāo)記物的活性、上調(diào)或下調(diào)，來評(píng)估藥物的功效。
免疫組化檢測(cè)的應(yīng)用（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
檢測(cè)對(duì)象
該技術(shù)主要在處理組織標(biāo)本方面發(fā)揮作用，涵蓋了石蠟切片（包括病理切片和組織芯片）、冰凍切片以及漂片等多個(gè)應(yīng)用。其中，石蠟切片是免疫組化中最為廣泛和基礎(chǔ)的一種應(yīng)用，因?yàn)樗軌虮３纸M織形態(tài)的完整性，支持連續(xù)切片，有助于進(jìn)行多指標(biāo)染色的對(duì)照觀察，并且能夠長(zhǎng)時(shí)間保存。
然而，在制作石蠟切片的過程中，蛋白質(zhì)可能因?yàn)楣潭ǘl(fā)生相互交聯(lián)，從而影響抗原抗體的結(jié)合。為了減輕這種影響，需要在免疫組化過程中進(jìn)行抗原修復(fù)的步驟。這一步驟的目的是通過合適的方法，如熱處理或酶解，解除蛋白質(zhì)的交聯(lián)，以提高抗體對(duì)抗原的特異性結(jié)合，確保準(zhǔn)確且可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)原理
實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)聚合酶技術(shù)把辣根過氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚酶上形成多聚物分子,其與待檢的抗原特異性的結(jié)合后，加入底物顯色。
免疫組化原理示意圖（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
實(shí)驗(yàn)材料與儀器
材料：石蠟切、PBS、檸檬酸鹽緩沖液、蒸餾水、增強(qiáng)劑、酶標(biāo)抗鼠、兔聚合物、蘇木素、酒精、二甲 苯、樹膠、鹽酸、二 氨 基 聯(lián) 苯 胺。
儀器：烘箱、微波盒、塑料切片架、顯微鏡、膠頭滴管。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。
2、石蠟切片首先被放置于67℃的烘箱中，經(jīng)過2小時(shí)的烘片處理，使蠟質(zhì)融化。然后，進(jìn)行脫蠟處理，將切片放入含有pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液的容器中。隨后，將容器放入微波盒中，通過微波加熱至沸騰。將脫蠟水化后的組織切片放在耐高溫塑料切片架上，再放入已沸騰的緩沖液中，使用中檔微波處理10分鐘。處理完成后，將微波盒取出，用流水自然冷卻。從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，然后用pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行2次3分鐘的沖洗。（注），并非所有的抗體都需要進(jìn)行微波修復(fù)，具體需根據(jù)實(shí)際情況而定。
3、每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。
4、除去PBS液，每張切片加1滴相應(yīng)的第一抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)），室溫下孵育2小時(shí)。
5、PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。
6、除去PBS液，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’。
7、除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液（二 氨 基 聯(lián) 苯 胺），顯微鏡下觀察5分鐘。
8、蘇木素復(fù)染，0.1%HCl分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲 苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。
實(shí)驗(yàn)流程圖（圖片來源網(wǎng)絡(luò)）
注意事項(xiàng)
1、在對(duì)切片施加首次抗體后，第二次抗體與一抗結(jié)合，并標(biāo)記上多聚螯合物酶（HRP）的復(fù)合物。多聚螯合物上攜帶有大量HRP分子，從而顯著放大抗原信號(hào)。這一方法相比于SABC（streptavidin-biotin-peroxidase complex）和SP法，具有更高的敏感性。
2、因?yàn)槎嗑畚镌谏矬w內(nèi)不存在，并且不使用生物素，因此成功避免了由生物素引起的非特異性背景染色。相對(duì)于SABC和SP法，這種方法的背景更為清晰。
3、辣根過氧化物酶與第二抗體結(jié)合在多聚物上，替代了傳統(tǒng)的第二抗體和第三抗體的使用，顯著減少了實(shí)驗(yàn)步驟。此外，試劑孵育時(shí)間僅需15分鐘，使得免疫組化方法更為簡(jiǎn)便，相較于SABC和SP法，實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間大大縮短。
案例展示
免疫組化應(yīng)用于去分化脂肪肉瘤的鑒別診斷：
去分化脂肪肉瘤主要發(fā)生于腹膜后、腹腔和盆腔等部位，患者的生存率受到局部復(fù)發(fā)無法控制的影響而較低。去分化脂肪肉瘤被定義為從高分化脂肪肉瘤突然過渡到非脂肪性的肉瘤，其中非脂肪性成分呈現(xiàn)多樣性形態(tài)，如梭形、上皮樣、多形性等，間質(zhì)黏液程度不一，大約10%的病例呈現(xiàn)異源性成分。若未采集到高分化脂肪肉瘤成分，則其形態(tài)學(xué)上并無特異性。非脂肪性成分可能在不同程度上表達(dá)SMA和desmin，從而容易與平滑肌肉瘤混淆。
然而，去分化脂肪肉瘤（以及高分化脂肪肉瘤）具備獨(dú)特的分子遺傳學(xué)變化，其中包括致癌基因MDM2和CDK4的高水平擴(kuò)增。MDM2在去分化脂肪肉瘤中被確定為一個(gè)明確的診斷標(biāo)志物。通過免疫組化檢測(cè)MDM2過表達(dá)或FISH檢測(cè)MDM2擴(kuò)增均可用于鑒別診斷。在此過程中，免疫組化檢測(cè)CDK4和MDM2的特異性較僅檢測(cè)MDM2更強(qiáng)。
