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在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域，免疫組化實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)至關(guān)重要的技術(shù)，其在疾病診斷、分子生物學(xué)研究以及藥物開發(fā)中發(fā)揮著不可替代的作用。 通過利用抗體與特定抗原之間的高度特異性結(jié)合，免疫組化實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚓_地定位、定性和定量目標(biāo)蛋白在組織或細(xì)胞中的表達(dá)情況。本文將深入探討免疫組化實(shí)驗(yàn)的原理、應(yīng)用、檢測(cè)對(duì)象，以及常見的問題和建議。
01 簡(jiǎn)介
免疫組化（IHC）是一種在組織或細(xì)胞水平上分析特定抗原存在的方法。通過利用高度特異性的抗體與目標(biāo)抗原結(jié)合的原理，它使得我們能夠可視化這些抗原的位置，并對(duì)其進(jìn)行定性和相對(duì)定量的研究。這項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵步驟包括首先與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的抗體的應(yīng)用，然后通過化學(xué)手段將這些抗體的位置顯現(xiàn)出來，從而允許我們對(duì)組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量的分析。
02 應(yīng)用范圍
免疫組化技術(shù)在臨床病理學(xué)中扮演著至關(guān)重要的角色，特別是在處理復(fù)雜病例、進(jìn)行診斷和鑒別診斷方面具有顯著的意義。其應(yīng)用廣泛，包括但不限于：確診和鑒別腫瘤類型、確定腫瘤原發(fā)位置、深入分析組織的病理學(xué)分類、進(jìn)行組織分類，以及利用免疫組織化學(xué)方法通過多種標(biāo)志物進(jìn)行軟組織腫瘤的準(zhǔn)確診斷，甚至可以發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移病灶等。 在科研領(lǐng)域中，免疫組化技術(shù)不僅可用于確定組織形態(tài)，還可用于檢測(cè)靶標(biāo)在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的定位，以及觀察蛋白質(zhì)表達(dá)的豐度等方面。
03 檢測(cè)對(duì)象
該技術(shù)主要用于處理組織標(biāo)本，包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）、冰凍切片以及漂片。其中，石蠟切片是免疫組化中最為普遍和基礎(chǔ)的一種，因?yàn)樗軌虮３纸M織形態(tài)的完整性，支持連續(xù)切片，有利于進(jìn)行多指標(biāo)染色的對(duì)照觀察，并能夠長時(shí)間保存。 然而，制作石蠟切片的過程中，蛋白質(zhì)可能因?yàn)楣潭ǘl(fā)生相互交聯(lián)，從而影響抗原抗體的結(jié)合。為減輕這一影響，需要進(jìn)行抗原修復(fù)的步驟。
04 實(shí)驗(yàn)步驟
具體步驟(石蠟切片) 1）、石蠟切片脫蠟至水： 結(jié)果分析 正常的結(jié)果應(yīng)該是：鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色。 結(jié)果分析的兩種方法是陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法和評(píng)分法。在陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法中，使用40倍鏡下的光學(xué)顯微鏡，在隨機(jī)選擇的10個(gè)視野下計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞的數(shù)量。而評(píng)分法則是在光學(xué)顯微鏡下，根據(jù)染色程度（0分代表無著色，1分代表淡黃色，2分代表淺褐色，3分代表深褐色）和陽性范圍（1分表示0-25%，2分表示26-50%，3分表示51-75%，4分表示76-100%），對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分，并將染色程度和陽性范圍的分?jǐn)?shù)相加得到最終分?jǐn)?shù)。 免疫組化結(jié)果分析 1）、對(duì)照染色：與實(shí)驗(yàn)中設(shè)立對(duì)照組類似，免疫組化也必須進(jìn)行對(duì)照染色，缺乏對(duì)照的結(jié)果不可靠。通常包括陽性組織對(duì)照、陰性組織對(duì)照、陰性試劑對(duì)照和自身對(duì)照，其中一個(gè)陽性組織和一個(gè)陰性組織對(duì)照足夠。 圖源網(wǎng)絡(luò) 4）、圖像分析儀：進(jìn)行精確定量需要使用圖像分析儀，有多種類型可選擇。推薦一款免費(fèi)軟件：Image J，該軟件簡(jiǎn)潔易用，可滿足一般免疫組化結(jié)果分析需求。 圖源網(wǎng)絡(luò)
依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液Ⅰ 10min——環(huán)保型脫蠟液Ⅱ 10min——環(huán)保型脫蠟液Ⅲ 10min——無水乙醇Ⅰ 5min——無水乙醇Ⅱ 5min——無水乙醇Ⅲ 5min——蒸餾水洗。
2）、抗原修復(fù)：
將切片浸沒在盛滿1×檸檬酸抗原修復(fù)液（pH 6.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8min、?；?min、中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH 7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
3）、阻斷內(nèi)源性過氧化酶：將切片放入3%雙氧 水溶液，室溫避光孵育25min。將玻片置于PBS（PH 7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
4）、畫圈：切片甩干后，組化筆在組織周圍畫圈。
5）、血清封閉：滴加3% BSA牛血清白蛋白，封閉30min。
6）、加一抗：輕輕甩掉封閉液，滴加稀釋好的一抗，平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。
7）、加二抗：將切片浸沒在置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育50min。
8）、DAB顯色：將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB工作液，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)適宜棕黃色陽性，用水沖洗終止顯色。
9）、復(fù)染細(xì)胞核：將切片放入蘇木素染液復(fù)染3min左右，用水沖洗，接著用蘇木素分化液分化數(shù)秒，用水沖洗，最后用蘇木素返藍(lán)液進(jìn)行返藍(lán)，用水沖洗。
10）、脫水封片：依次將切片放入無水乙醇Ⅰ5min——無水乙醇Ⅱ 5min——無水乙醇Ⅲ 5min——無水乙醇Ⅳ 5min——環(huán)保型脫蠟液 5min，拿出來晾干，用中性樹膠封片。
2）、定位：抗原表達(dá)應(yīng)在特定部位，例如，LCA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上，CK應(yīng)在細(xì)胞漿內(nèi)，PCNA和p53蛋白應(yīng)在細(xì)胞核內(nèi)。未在抗原所在部位呈陽性著色不能視為確切陽性結(jié)果，可能是非特異性染色或假陽性。若存在不確定性，需使用上述提到的對(duì)照染色。
3）、半定量：現(xiàn)今通常使用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量，但如果實(shí)驗(yàn)室條件有限，可使用肉眼進(jìn)行半定量評(píng)估。免疫組化的半定量通常分為三級(jí)：弱（+）、中（++）、強(qiáng)（+++）。觀察5-10個(gè)高倍視野（HPF），根據(jù)弱（+）=1、中（++）=2、強(qiáng)（+++）=3進(jìn)行評(píng)分。通過計(jì)算（+）% × 1 +（++）% × 2 +（+++）% × 3得出數(shù)值，總值<1.0為（+），1.0-1.5為（++），>1.5為（+++）。
05 常見問題及建議
常見的非特異性染色：
1）、抗體問題：一抗用多克隆抗體容易出現(xiàn)非特異性染色，建議用高純度，高效價(jià)的針對(duì)更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。
2）、抗體濃度過高/孵育時(shí)間過長：每次使用新抗體前應(yīng)該多做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索出最理想的工作濃度，不能簡(jiǎn)單地按照說明書來用。另一個(gè)常見原因就是孵育時(shí)間過長。解決的辦法就是定時(shí)器。
3）、DAB染色時(shí)間太長/變質(zhì)：DAB的孵育時(shí)間過長，會(huì)造成背景非特異性染色。DAB的顯色時(shí)間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現(xiàn)淺淺的棕色的時(shí)候，就要馬上沖洗。出現(xiàn)棕色的時(shí)間過短，表明抗體濃度過高；出現(xiàn)棕色的時(shí)間過長，表明抗體濃度過低。
4）、內(nèi)源性酶和生物素：內(nèi)源性酶和生物素也會(huì)造成非特異性染色，特別是一些內(nèi)源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活堿性磷酸酶
5）、組織變干：一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2 mm。然后用PAP筆在組織周圍畫一個(gè)圈圈，把修復(fù)液圈在里面。避免修復(fù)液流走。圈圈應(yīng)該距離組織邊緣3-4 mm。
6）、浸泡時(shí)間過長：切片在緩沖液或修復(fù)液里面浸泡過夜。
7）、清洗不充分：清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再次測(cè)PH值。
8）、封閉血清問題：原則是選擇二抗動(dòng)物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。