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什么是電泳？
電泳是一項(xiàng)利用電流根據(jù)DNA、RNA或蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)（例如大小和電荷）進(jìn)行分離的技術(shù)。
02 什么是瓊脂糖凝膠電泳？
瓊脂糖凝膠電泳是一種基于核酸（如DNA）分子大小的分離和識別技術(shù)。在這項(xiàng)技術(shù)中，不同大小的DNA片段被加載到由紅藻提取的碳水化合物瓊脂糖制成的多孔凝膠上。在施加電場的情況下，DNA片段在凝膠中移動，較小的片段移動速度較快，而較大的片段則移動較慢。通過與一系列已知大小的DNA片段（稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣）位置的比較，可以準(zhǔn)確確定分子的大小。然而，對于RNA而言，由于可能存在多種二級結(jié)構(gòu)，其遷移方式變得復(fù)雜，因此瓊脂糖凝膠在RNA大小分析方面不太適用。可行的替代方法包括RNA印跡法和變性瓊脂糖凝膠電泳，因?yàn)樗鼈兪褂玫臈l件可以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)。此外，瓊脂糖凝膠也可用于根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和電荷進(jìn)行分離，盡管它的孔徑較大，因此通常使用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，以提供更高的分辨率，特別適用于小蛋白質(zhì)分子。
03 工作原理
瓊脂糖，作為瓊脂的成分之一，構(gòu)成了一個(gè)立體的凝膠基質(zhì)，由螺旋狀的瓊脂糖分子組成。這些螺旋狀的分子通過氫鍵在超線圈束中緊密固定，形成通道和孔隙，使分子能夠穿過。在加熱的過程中，這些氫鍵斷裂，導(dǎo)致瓊脂糖從凝膠狀態(tài)變?yōu)橐后w狀態(tài)，使其可以在恢復(fù)形狀前被倒入模具。
【圖片1】瓊脂糖凝膠中的孔隙形成和溫度誘導(dǎo)的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。
凝膠中瓊脂糖的含量直接調(diào)控了孔隙的尺寸，進(jìn)而影響了分子的可透過性和遷移速度。百分比較高的瓊脂糖使孔徑減小，因而只有較小的分子可以通過，其遷移速度也較慢。
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中，常使用0.7~1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行日常DNA分離。這種凝膠對0.2-10kb范圍內(nèi)的片段提供了明顯而清晰的分辨率。較大的DNA片段可以采用較低百分比的凝膠，但會變得易碎難處理，而較高百分比的凝膠則能更好地分辨小片段，但可能凝固不均勻。
鑒于DNA在肉眼中無法直接觀察，因此在凝膠凝固時(shí)會加入一種夾層染料，如溴化乙錠（EtBr），以渲染凝膠。該染料會與DNA結(jié)合，并在紫外線照射下發(fā)出熒光，使得DNA片段成為可見。DNA的存在越多，相應(yīng)的條帶就會越亮。
與加載染料混合的樣本被放置在凝膠的一端，凝膠被浸泡在運(yùn)行緩沖液中。然后電流通過凝膠槽兩端的電極穿過凝膠。
在樣品充分分離后，將凝膠從槽中取出，置于紫外光箱上。夾層染料使得樣品的條帶可見，通過與已知大小的DNA標(biāo)記進(jìn)行比較，可以確定其尺寸。由于遷移距離和片段大小之間存在非線性關(guān)系，因此包含尺寸標(biāo)記是至關(guān)重要的，可用作指導(dǎo)分析的依據(jù)。
A）圖片左側(cè)描述了DNA電泳的典型結(jié)果。在左邊，有一個(gè)尺寸標(biāo)記，用來作為樣品DNA片段長度（以堿基對為單位）的參考。標(biāo)記的右邊是三個(gè)樣品。圖片顯示了較小的DNA片段如何在瓊脂糖凝膠中比較大的DNA片段移動得更遠(yuǎn)。
B) 圖片右側(cè)的圖表顯示了DNA片段的大小與遷移距離之間的非線性關(guān)系。這是一條負(fù)的曲線，當(dāng)DNA片段變大時(shí)，它們在凝膠中遷移的距離就會減少。
04 實(shí)驗(yàn)材料
DNA、瓊脂糖、TBE電泳緩沖液、電泳載樣緩沖液、溴化乙錠(EB)溶液母液、 DNAGreen、水平式電泳裝置、電泳儀、臺式高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、微量移液槍、微波爐或電爐、紫外透射儀、照相支架、照相機(jī)及其附件。
05 實(shí)驗(yàn)步驟
1.試劑配制 5×TBE緩沖液：450 mmol/L Tris-硼 酸，10 mmol/L EDTA，pH值8.0。使用時(shí)將上述儲存液稀釋10倍至0.5×TBE緩沖液，可同時(shí)作為電泳及制膠用的緩沖液。 2.制膠 制膠的過程如下： 1. 根據(jù)需要的凝膠量和濃度，在含有一定量電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉（總體積不超過錐瓶容量的50%）。 2. 在錐瓶口蓋上保鮮膜或牛皮紙，并在膜或紙上扎小孔，然后將其放入微波爐加熱溶解瓊脂糖。加熱時(shí)，當(dāng)溶液開始沸騰時(shí)，戴上防熱手套小心搖動錐瓶，使瓊脂糖充分均勻溶解。重復(fù)此操作直至瓊脂糖完全溶解。 3. 將溶液冷卻至約50℃-60℃，可在此時(shí)加入溴化乙錠溶液（終濃度0.5 μg/ml）或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混勻。 4. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后插入梳子到適當(dāng)位置。凝膠厚度一般在3~5 mm之間。小膠需要約25-30 mL的瓊脂糖溶液，而大膠則需要約60-70 mL。如果需要切割和回收膠，可以適當(dāng)增加凝膠厚度。 5. 在室溫下等待約30分鐘~1小時(shí)，直至凝膠完全固化。 3.上樣 上樣的步驟如下： 1. 取適量樣品，并與6×上樣緩沖液混合均勻（例如，1 μl樣品與5 μl 6×上樣緩沖液），然后用微量移液槍小心地將混合液加入樣品槽中。 2. 根據(jù)樣品濃度可以適當(dāng)調(diào)整上樣量。如果樣品中DNA含量較低，可以按照上述比例增加上樣量，但總體積不得超過樣品槽的容量限制（通常小孔最多為40 μl，大孔最多為200 μl，具體限制取決于制膠膜的規(guī)格）。 3. 每加完一個(gè)樣品后要更換微量移液槍頭，以防止樣品間相互污染。在上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。 4.電泳 進(jìn)行電泳的步驟如下： 1. 在加完樣品后，蓋上電泳槽蓋，并立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?10 V，電流維持在40 mA以上。 2. 當(dāng)條帶移動到距離凝膠前沿約2 cm的位置時(shí)（大約40分鐘左右），停止電泳。 3. 使用紫外線下拍照并觀察結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)過程
06 注意事項(xiàng)
以下是瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的技巧和注意事項(xiàng)： 以下是關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的技巧和注意事項(xiàng)： 1. 使用水替代凝膠緩沖液或電泳緩沖液是不可取的。通常，瓊脂糖凝膠制備和電泳需要使用TAE或TBE緩沖液。如果使用水，凝膠在電泳過程中會迅速融化。因此，在凝膠配制時(shí)，請檢查容器標(biāo)簽以確保使用正確的緩沖液。 2. 使用錯(cuò)誤濃度的瓊脂糖也會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)的DNA凝膠電泳所需瓊脂糖濃度為1.0%。濃度越高，可以獲得更高分辨率的小片段；反之，濃度越低，可以獲得更高分離程度和分辨率的大片段。使用錯(cuò)誤濃度的瓊脂糖凝膠會使DNA條帶的可靠性受到影響。注意，低百分比濃度的瓊脂糖凝膠往往較軟，更容易破損。 3. 注意正確連接電泳槽與電源連接線的方向。如果不小心顛倒連接線的方向，樣品會朝相反方向移動，導(dǎo)致樣品丟失。 4. 選擇適合您實(shí)驗(yàn)的正確緩沖液非常重要。常用的緩沖液類型包括TAE和TBE，選擇取決于DNA片段大小和實(shí)驗(yàn)后的應(yīng)用。 5. 為了獲得最佳分辨率，需要根據(jù)DNA含量確定上樣量。最小可檢測的DNA量取決于使用的染色方法，例如使用SYBR Safe DNA凝膠染色可以檢測到3 ng的DNA。 6. 凝膠的配制會影響條帶的分辨率。推薦的凝膠厚度為3-4 mm，過厚的凝膠會產(chǎn)生模糊的條帶和較高的染色背景。梳齒的厚度也很重要，薄梳會產(chǎn)生清晰的條帶，而厚梳會導(dǎo)致分辨率降低。 7. 凝膠類型會影響DNA的分辨率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的瓊脂糖類型。 8. 選擇適當(dāng)?shù)碾娪具\(yùn)行條件很重要，包括電壓和距離。推薦的電壓范圍是4–10 V/cm，電壓太低會降低遷移率，電壓太高會降低分辨率。 9. 如果DNA條帶呈微笑狀或波浪形，可以嘗試提高灌膠溫度、使用小分子核酸染料，或者在電泳結(jié)束后進(jìn)行染色處理。
09 其他
1.瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍：
